Avicenne XXI siècle

Procédés analytiques

Biologie moléculaire 6 Feb 2012

Southern-blot

Dans un Southern-blot, on sépare des fragments d'ADN par électrophorèse, puis on les transfère par des forces capillaires ou électrophorétiques du gel sur une membrane immobilisante où on peut les hybrider avec des sondes spécifiques. Les fragments d'ADN peuvent être produits à partir d'ADN génomique à l'aide d'une digestion par des enzymes de restriction ou par reaction de polymérase en chaîne (PCR). La détection des fragments d'ADN se fait à l'aide de sondes marquées (radioactives ou non) qui forment des hybrides avec les séquences complémentaires par des ponts d'hydrogène. L'hybridation des sondes marquées est finalement détectée par une autoradiographie ou à l'aide de chromogènes.

Northern-blot

L'hybridation à l'ARN fixé est appelée Northern-blot. On détermine la taille et le nombre de molécules d'ARNm spécifiques dans une préparation d'ARN total ou poly. L'ARN est sépare par électrophorèse et transféré sur une membrane. L'ARN d'intérêt est ensuite détecté après hybridation avec une sonde marquée.

Réaction de polymérase en chaîne (PCR)

La PCR (polymérase chain reaction) permet la multiplication enzymatique des séquences d'intérêt avant leur détection. Le principe de la réaction consiste à répéter un cycle d'amplification dont les étapes individuelles sont effectuées à des températures précises. Tout d'abord, on dénature l'ADN double brin (ou l'ADNc obtenu après transcription inverse d'ARN). Des amorces (primers) spécifiques des séquences recherchées peuvent maintenant s'hybrider aux simples brins produits (annealing). Dans l'étape suivante, un nouveau brin complémentaire à la matrice est produit à partir du bout 3' de l'amorce par une polymérase thermostable (par exemple Taq-polymérase ; élongation}. Les étapes de dénaturation, d'hybridation et d'élongation sont répétées environ 30 fois. La quantité de la séquence recherchée est ainsi multipliée de façon exponentielle puisque chaque brin nouvellement synthétisé par la polymérase peut servir de matrice dans le cycle d'amplification suivant.

Les produits de la PCR sont enfin séparés par électrophorèse et visualisés sous lumière UV a l'aide d'un réactif intercalant, le bromure d'éthidium.

Séquençage de l'ADN

La synthèse enzymatique de fragments d'ADN appelée méthode de la terminaison des chaînes est la méthode la plus répandue de séquençage d'ADN. On dispose aujourd'hui de plusieurs systèmes de séquençage automatisé qui se servent d'amorces ou de terminaisons (didésoxynucléotides terminant les chaînes) marqués avec un réactif fluorescent. Les quatre réactifs fluorescents émettent de la lumière de longueurs d'ondes différentes. Les détecteurs d'une machine équipée d'un laser à l'argon enregistrent les signaux émis par les différents réactifs pendant la migration électrophorétique.

Plus récemment, on a développé le séquençage de simples brins à l'aide d'amorces biotinylées. Dans l'exemple présenté, la séquence spécifique est contenue dans l'insert d'un phage (λ-gt II). L'amorce biotinylée (forward primer} contient la séquence recherchée et une séquence 5' identique à celle d'une amorce universelle de séquençage. L'amorce non biotinylée (reverse primer) contient la séquence spécifique 3' et une séquence 5' complémentaire d'une amorce universelle inverse. Après amplification par PCR en présence de terminateurs, les produits d'amplification biotinylés peuvent être récupérés à l'aide de billes paramagnétiques couplées à la streptavidine et enfin être élues à un pH alcalin. Les billes peuvent aussi être utilisées pour un séquençage en phase solide.